如何设计过表达引物

今天给大家分享过表达引物设计网站，其中也会对如何设计过表达引物的内容是什么进行解释。

简述信息一览：

• 1、在线设计引物网站有哪些-如何快速设计shRNA
• 2、基因的过表达载体构建时,如何设计引物。?
• 3、【实用讲解】NCBI使用教程:QPCR引物设计
• 4、如何设计PCR引物?
• 5、那些好用的在线引物设计工具

在线设计引物网站有哪些-如何快速设计shRNA

之前NCBI上有一个probe选项可以直接设计引物，上面会给出上下游序列。

shRNA引物设计包括数据库介绍、输入基因ID、选择推荐的靶点序列、添加酶切位点和Loop环结构，以及设计shRNA片段。将Oligo片段正反向混合退火后，即可与载体连接，构建shRNA干扰载体。

首先是实验设计 详情见：CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计 https：// sgRNA的合成和投递有两种方式：A）PCR；B）单独的sgRNA的表达质粒。A）PCR扩增的方法 U6：来源于人U6小核启动子，常用小RNA 表达，转录本为shRNA。

基因研究中，敲除基因，研究该基因的功能是最常用的套路。一般 ShRNA 可通过 RNA 干扰来抑制基因的表达， 是基因研究中必不可少的环节。下面就主要围绕设计 ShRNA 引物序列，手把手教你构建 ShRNA 质粒，轻松敲基因。

有趣的是，除了短双链RNA，短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，从而产生RNA干扰（7）。这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能（8）。

LifeTechnologies公司有个非常实用的在线shRNA设计软件，操作非常方便，而且设计出来的shRNA不再需要到NCBI上Blast，直接可以用的。

基因的过表达载体构建时,如何设计引物。?

构建基因过表达载体之设计引物的详细步骤如下：确定目标基因序列：从权威的Gene数据库中搜索并锁定目标基因。找到对应的NM_xxxx编号，并下载CDS序列。选择适合的载体：选择常用的载体，如PCIneo。注意载体上的双酶切位点选择，应挑选不在CDS区域且具有共同Buffer的两个酶。

构建基因过表达载体时，设计引物的步骤如下：首先，利用Primer Premier 5等软件获取目标基因如p53的CDS序列。此步骤涉及在Gene数据库中搜索目标基因，选择正确物种和isoform。确保选择正确的CDS序列以用于后续的载体构建。接下来，选择合适的表达载体，如PCI-neo，pCMV等。载体的选择依据表达目的和需求。

设计引物时，需从p53基因的CDS序列开始，分别选择特定的序列作为上下游引物，以避免在全基因组PCR扩增时可能出现的非特异性扩增。通过NCBI数据库的引物特异性检测，验证引物的特异性。在构建载体时，需要确保p53序列的插入不会导致读码框的改变，因此需要在引物中添加额外的碱基序列以保持正确的读码框。

对于下游引物，我们进一步考虑了保护碱基，确保酶切位点的稳定连接（4 图）。最终，我们的引物组合如下：上游引物为CTCGAG CG ATGGAGGAGCCGCAGTCAG，下游引物为ATA GC GGCC GC TCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC。

【实用讲解】NCBI使用教程:QPCR引物设计

进行引物设计前，需查找序列并打开Primer-BLAST。有两种方法：一是通过NCBI主页的Blast功能找到目的基因mRNA页面，点击右侧工具栏内的Pick Primers。二是***目的序列后，在NCBI主页直接使用Primer-BLAST。在Primer-BLAST中输入相关参数。通常无需勾选intron inclusion，以免导致DNA污染。

首先，访问NCBI找到目标基因的序列页面，然后点击Pick Primers跳转到引物设计工具。如果你已有基因序列，可直接通过NCBI的BLAST进入Primer-Blast页面。进入设计页面后，分为四个模块设置参数：PCR模板、引物参数、外显子/内含子选择和特异性检测。

首先，访问Primer-BLAST工具，可通过Blast主页或直接链接进入。输入目标基因，如人类GSR基因，有两种途径：一是从目的基因mRNA页面挑选手动设计，二是直接***序列在Blast界面选择Primer-BLAST。在工具中，设置参数时，注意防止DNA污染，但intron inclusion的选项可能需要谨慎处理。

NCBI在线设计引物的实用指南 要设计高质量的QPCR引物，首先需要确定目标基因。以人类β-actin基因为例，寻找其NM号开头的mRNA序列，因为这是实验中常用的。Actin基因的CDS区位于193-1320碱基之间，是设计引物的理想区域。

如何设计PCR引物?

1、方法/步骤 首先打开NCBI，选择“Nucleotide”，并在搜索框输入基因名。一般用目标基因的突变体1去设计引物，也就是要选择目标基因的“transcriptvariant1，mRNA”，没有1就用3，以此类推。因为是Q-PCR，所以要去掉内含子，因此用mRNA。从上一个页面点击FASTA，可以看到mRNA的序列。

2、普通PCR引物设计步骤：明确目标序列 需要首先明确要扩增的DNA序列，这是设计PCR引物的首要前提。这段序列应该是已知的，并且具有足够的信息用于设计特异性引物。选择引物设计软件 可以使用在线的引物设计工具或专业软件，如Primer Premier、Vector NTI等。

3、引物设计是荧光定量PCR成功的关键步骤之一，它直接影响扩增效率与产物的特异性。引物设计的原则主要包括选择合适的扩增长度、设定合适的Tm值、确保引物与模板的特异性结合等。

4、设计PCR引物是分子生物学中不可或缺的技能，尤其是对于初学者而言。小胖师兄分享了两种设计引物的方法，它们基于两个关键数据库：UCSC和NCBI中的primer blast。以下内容将详细介绍如何使用这些方法来设计引物。

那些好用的在线引物设计工具

1、Primer3Plus是一个开源的在线引物设计工具，操作简便。只需上传基因序列文件，保持默认参数设置后，通过点击Pick Primers按钮，即可生成设计好的引物。PrimerBank是哈佛大学维护的一个公共资源，专为PCR引物设计提供。它包含了大量经过验证的引物，适用于人类和小鼠基因的表达量检测或定量qPCR。

2、PrimerBLAST 功能特点：在线工具，结合BLAST算法进行引物特异性搜索，特别适用于荧光PCR引物设计。 优势：强大且免费的在线工具，能够快速验证引物的特异性和潜在的非特异性结合位点。 primer3 功能特点：在线工具，适用于设计普通PCR引物，提供多种参数设置以满足不同需求。

3、在线工具方面，Primer-BLAST以其在荧光PCR引物设计的强大功能脱颖而出，primer3 web是设计普通PCR的常用免费工具，PrimerBank则是一个丰富的PCR引物资源库，Primerexplore则专为LAMP引物设计服务。这些工具各有特色，可根据研究需求进行选择和使用。

关于过表达引物设计网站，以及如何设计过表达引物的相关信息分享结束，感谢你的耐心阅读，希望对你有所帮助。