sirna设计网站

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简述信息一览：

• 1、为何sirna药物在人体治疗中给药间隔那么久?
• 2、小白快速上手!siRNA的设计
• 3、siRNA设计,合成及转染
• 4、sirna设计网站-如何快速设计shRNA
• 5、如何在线设计siRNA?
• 6、shRNA序列设计:一个较为特殊的案例

为何sirna药物在人体治疗中给药间隔那么久?

基于肝细胞自身生命周期也较长（5~6个月），因此，靶向肝脏的小干扰RNA药物给药间隔也较长。

基因鸡尾酒疗法的崛起，为癌症治疗带来了革命性的变化。以siRNA为核心，这种疗法通过精确靶向癌细胞，有效阻止了癌细胞的分裂与扩散。例如，艾利兰公司的ALN-VSPo1就展现了出色的抗癌效果，不仅能停止两种癌细胞的再生，还能阻断肿瘤的血供，为治疗提供了新的可能性。

Onpattro用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）引起的周围多发性神经病。其作用机制是沉默hATTR mRNA，减少hTTR蛋白的产生，进而减少周围神经中的淀粉样沉积，达到治疗效果。临床给药途径为静脉输注，每3周给药一次。siRNA分子分子量约为14kD，具有大分子生物特性。

排泄途径主要通过尿液和胆汁。siRNA原型药物主要在给药后24小时内通过尿液排出体外，而大部分药物被肝脏迅速吸收。肝脏是药物消除的主要场所，其消除半衰期较长。药物相互作用的研究结果显示，已上市的siRNA药物对CYP酶和转运体的影响不大。

年7月14日， 美国生物制药公司圣诺制药（Sirnaomics）宣布，该公司候选药物STP705在用于预防瘢痕增生的2期临床试验中完成首位患者的剂量给药。STP705是一种siRNA（小干扰RNA）疗法，能够利用双靶向抑制特性和多肽纳米颗粒（PNP）增强的传递直接抑制TGF-β1和COX-2基因的表达。

目前，全球乙肝治疗缺乏有效治愈手段，腾盛博药的创新疗法——利用B细胞和T细胞免疫蛋白（BRII-179）以及siRNA疗法（BRII-835），旨在恢复人体对乙肝的免疫控制，可能为慢性乙肝患者带来治愈的希望。

小白快速上手!siRNA的设计

1、操作流程如诗行般流畅：首先，输入Accession Number，锁定目标区域（ORF或UTR），确认你的研究对象是Mus musculus。接下来，是设计的黄金时刻，你将看到一个个候选siRNA跃然屏幕上，如5-CCCAGAGTTCTTTGCTCCGCTTATT-3，每一个序列都蕴含着可能性。

siRNA设计,合成及转染

转染前1 h使用无血清培养基换液，避免转染试剂与血清中复合物形成沉淀，提升转染效率。若转染效率不佳，可提高细胞融合度至80~90%。 转染复合液制备使用前，轻轻摇匀Lipo试剂，取5 μL稀释至250 μL无血清培养液，室温静置5 min。

常规化学合成的siRNA，以21-23nt的双链形式提供，冻干形式的即用试剂可以稳定保存在-20℃至-80℃长达一年。使用时，需将siRNA粉末短暂离心，然后用DEPC-DW或无菌水溶解。推荐使用100pmole/μl浓度长期储存，超过2个月需置于-70°C以保持最佳效果，但需注意冻融次数不宜超过五次。

siRNA转染实验是一种利用RNA干扰技术特异性抑制基因表达的实验方法。以下是关于siRNA转染实验的详细解 实验原理： RNA干扰：通过胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA裂解成由2125个核苷酸组成的siRNA。 siRNA与RISC结合：siRNA与体内蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC。

转染时，将siRNA和转染试剂在室温下混合20分钟，然后均匀加入到细胞板中，培养48-72小时。检测转染效果通常在转染后48-72小时进行，可***用QPCR和WB等方法。QPCR推荐在24h到48h检测，应将引物设计在沉默位点两侧，以准确评估沉默效果。

sirna设计网站-如何快速设计shRNA

LifeTechnologies公司有个非常实用的在线shRNA设计软件，操作非常方便，而且设计出来的shRNA不再需要到NCBI上Blast，直接可以用的。

输入RNA名字和序列（FASTA格式），点击Run ***ysis。网站根据评分高低排序设计的siRNA，去除评分低于90分的siRNA，选择排名靠前的siRNA进行设计。 invivogen设计网站（invivogen.com/sirnawiza...）输入RNA序列，点击search。网站不仅提供siRNA序列，还提供shRNA序列设计。

shRNA引物设计包括数据库介绍、输入基因ID、选择推荐的靶点序列、添加酶切位点和Loop环结构，以及设计shRNA片段。将Oligo片段正反向混合退火后，即可与载体连接，构建shRNA干扰载体。

shRNA设计原则围绕高效、特异性和安全性展开。首先，选择靶标时需综合考虑其特异性，避免非特异性干扰。推荐***用多个靶标以提高干扰效果。值得注意的是，shRNA序列中应避免连续四个以上的T，以防止成为RNA聚合酶III的终止信号。

如何在线设计siRNA?

以下是三种常用的siRNA在线设计网站： siDirect设计网站（sidirectrnai.jp/）输入NCBI序列号或序列信息（FASTA格式），点击design siRNA。网站将提供一系列siRNA设计，包括Tm值、脱靶效应等评估信息。

设计步骤： 利用在线工具：可以利用如sidirectrnai.jp/、rnaidesigner.thermofisher.com或invivogen.com/sirnawiza等在线工具进行设计。 输入CDS序列：以目标基因为例，找到其转录本，输入CDS序列进行设计。 Blast分析：设计完成后，通过Blast分析筛选特异性高的序列。

点击你要的序列号，会进入这个基因的基本信息，一直往下拉会看到mRNAandProtein（s），NM开头的序列号就是其CDNA的序列了。

设计时还需考虑序列特异性，建议设计多条siRNA以覆盖不同位置，确保高效沉默。siRNA设计网站如DSIR、siDirect和Thermofisher提供了便捷的在线设计工具。设计时需在NCBI查找基因编号和序列，注意选择各剪接体共享位置和区别于其他基因保守位置。

选择siRNA、shRNA或miRNA时，需考虑实验目的和细胞特性。siRNA适用于快速检测，shRNA适用于稳定沉默基因或植物研究，而miRNA适用于内源调控研究和跨物种研究。设计时需注意特异性、序列长度和热力学性质，以及结合在线工具进行辅助设计。

RNA干扰的类别包括siRNA、microRNA（miRNA）和shRNA。siRNA由dsRNA结合核酶复合物形成RNA诱导沉默复合物，通过碱基配对定位到同源mRNA上，切割mRNA。miRNA由内源性发夹结构转录产物衍生而来，靶向干扰成熟miRNA。shRNA是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，通过RNA干扰来抑制基因表达。

shRNA序列设计:一个较为特殊的案例

1、综上所述，在特殊质粒背景下设计PROK1 shRNA时，所使用的BsaI酶切位点能够实现与双酶切相似的效果。因此，在设计过程中，应充分考虑质粒特异性酶切位点的限制，并灵活运用酶切特点来调整序列设计，以确保shRNA序列与所使用的质粒兼容。在特殊情况下，BsaI单酶切能够为设计提供额外的灵活性，使实验者能够在不影响shRNA功能的前提下，克服酶切位点的限制。

2、设计shRNA时，碰到的特殊案例与BsaI内切酶相关，引发了一番思考。原本以为是单酶切，但查阅文献后得知，BsaI单酶切实际上能起到双酶切的效果，这令人惊讶。

3、RNA干扰（RNA interfering， RNAi）利用AAV病毒载体表达shRNA进行基因沉默，具有高度序列专一性，能特异性抑制基因表达，用于功能基因组学研究、基因功能研究、信号通路研究、构建疾病模型和基因治疗。shRNA载体设计包括干扰序列设计、载体构建、筛选检测、rAAV包装与纯化、滴度检测等步骤。

4、对于miR30-shRNA干扰载体，设计要点在于引导序列需与靶DNA完美互补，并模仿人类miRNA30的结构。为避免非特异性结合，应确保有义链的第一个碱基与靶序列的5’端第一个碱基的互补性。例如，若靶序列的5’端第一个碱基为A，则引导序列的第一个碱基应为C；若为G，则应为T。

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